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本试剂盒是专为两步法RT-PCR第一步实验配制的cDNA第一链合成试剂盒。本试剂盒中使用的HfScript逆转录酶是M-MLV由来的新型高效逆转录酶，新颖突变位点大幅提升酶的转录活性，cDNA第一链合成的效率和产量更高，可利用pg级的总RNA或mRNA合成cDNA第一链。点突变消除RNase H活性，酶的延伸性能提高，有效改善逆转录酶与RNA模板的亲和力，可获得长至12kb的cDNA。精心优化的RT Buffer使逆转录酶应用范围更广，对后续的PCR以及定量PCR实验兼容性高。该试剂盒配备所有逆转录试剂，使用简单方便。适用于第一链cDNA的合成和后续的RT-PCR、RT-qPCR，以及全长cDNA文库的构建等。

• 高效的逆转录效率：新颖突变位点大幅提升酶活性能，获得更高产量的cDNA。
  
• 良好的延伸能力：点突变消除RNase H活性，改善逆转录酶与RNA模板的亲和力，可获得长至12kb的cDNA。
  
• 灵敏度高：可利用pg级的总RNA或mRNA模板合成cDNA第一链。
  
• 使用方便：逆转录试剂盒中已配备所有逆转录试剂，仅需准备模板即可轻松完成逆转录。

• 在操作过程中应避免RNase污染，防止RNA降解或实验中的交叉污染，建议在专门的区域进行RNA操作，使用专门的仪器和耗材，操作人员带口罩和一次性手套并经常更换手套。
  
• 实验尽量使用一次性塑料器皿，若使用玻璃器皿，应使用0.1%DEPC(焦碳酸二乙酯)水溶液在37℃处理12小时，并在120℃下高压灭菌30分钟后使用，或者将玻璃器皿在180℃下干热灭菌60分钟后使用。实验中用到的无菌水应使用0.1%的DEPC处理后进行高压灭菌。
  
• 本试剂盒中的所有试剂使用前请上下颠倒轻轻混匀，尽量避免起泡，并经短暂离心后使用。所涉及的酶类使用后应尽快放回-20℃，避免反复冻融。

• 逆转录操作步骤：
  
  • 将RNA模板、Primer Mix、dNTP Mix、DTT、RT Buffer、HfScript和RNase-FreeWater溶解并置于冰上备用。
    
  • 根据以下表格配制反应体系，总体积为20μL。
    

    成分	用量	终浓度
    dNTP Mix(2.5mM Each)	4μL	500μM Each
    Primer Mix	2μL
    RNA Template	X μL
    5×RT Buffer	4μL	1×
    DTT(100mM)	2μL	10mM
    HfScript逆转录酶(200U/μL)	1μL
    RNase-Free Water	至20μL

    注意：
    
    • 若起始RNA的量小于50ng，则建议加入RNA酶抑制剂(货号：WE0223)。本试剂盒并未提供，如需要可单独向本公司订购。
      
    • Primer Mix由Oligo(dT)和Random Primer配制而成。
  • 涡旋震荡混匀，短暂离心，使管壁上的溶液收集到管底。
    
  • cDNA合成反应条件：
    
    • 若下游进行荧光定量PCR检测，42℃孵育15分钟，85℃孵育5分钟。
      
    • 若下游进行普通PCR检测，42℃孵育30～50分钟，85℃孵育5分钟。
      注意：对于二级结构复杂或GC含量高的模板，可以提高逆转录温度至50℃，增强逆转录效率。
  • 反应结束后，短暂离心，置于冰上冷却。
    
  • 逆转录产物可直接用于PCR反应和荧光定量PCR反应，或置于-20℃长期保存。
  
  
• 若逆转录效率低，或RNA模板二级结构复杂、GC含量高时，建议采用以下步骤：
  
  • 将RNA模板、Primer Mix、dNTP Mix、DTT、RT Buffer、HfScript和RNase-FreeWater溶解并置于冰上备用。
    
  • 根据以下表格配制反应体系，总体积为13μL。
    

    成分	用量	终浓度
    dNTP Mix(2.5mM Each)	4μL	500μM Each
    Primer Mix	2μL
    RNA Template	X μL	50pg～5μg
    RNase-Free Water	至13μL

  • 70℃孵育10分钟，迅速冰浴2分钟。
    
  • 短暂离心，使管壁上的溶液收集到管底。
    
  • 继续向以上反应液中加入以下试剂：

    成分	用量	终浓度
    5×RT Buffer	4μL	1×
    DTT(100mM)	2μL	10mM
    HfScript逆转录酶(200U/μL)	1μL

    注意：
    
    • 若起始RNA的量小于50ng，则建议加入RNA酶抑制剂(货号：WE0223)。本试剂盒并未提供，如需要可单独向本公司订购。
      
    • Primer Mix由Oligo(dT)和Random primer配制而成。
  • 进行cDNA第一链合成：
    
    • 若下游进行荧光定量PCR检测，50℃孵育15分钟，85℃孵育5分钟。
      
    • 若下游进行普通PCR检测，50℃孵育30～50分钟，85℃孵育5分钟。
  • 反应结束后，短暂离心，置于冰上冷却。
    
  • 逆转录产物可直接用于PCR反应和荧光定量PCR反应，加入量应小于PCR反应体系的1/10，或置于-20℃长期保存。